PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究
CSTR:
作者:
作者单位:

(1. 陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西 西安 710119;2. 陕西省猕猴桃工程技术研究中心,陕西 西安 710404;3. 陕西省农村科技开发中心,陕西 西安 710054)

作者简介:

肖妍,女,陕西师范大学在读硕士研究生。

通讯作者:

高贵田(1964-),男,陕西师范大学副教授,硕导,博士。E-mail:gaoguitian2006@snnu.edu.cn雷玉山(1963-),男,陕西省猕猴桃工程技术研究中心研究员,硕导,博士。E-mail:leiyush@163.com

中图分类号:

基金项目:

陕西省科技厅特色产业链项目(编号:2018TSCXL-NY-01-05);西安市农业科技创新计划项目\[编号:2017050NC/NY009(3)\]


PMA-qPCR for detecting live bacteria of Shaanxi kiwifruit cancer dominant pathogen
Author:
Affiliation:

(1. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710119, China; 2. Shaanxi Kiwifruit Engineering Technology Research Center, Xi’an, Shaanxi 710404, China; 3. Shaanxi Rural Science and Technology Development Center, Xi’an, Shaanxi 710054, China)

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    摘要:

    将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量。通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件。结果表明,Psa经98.3 ℃沸水浴处理13 min可完全致死,Psa死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105 μg/mL,最佳暗育时间为8 min,最佳曝光时间为20 min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.220 4x+37.73,R2=0.995 5,最低可检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符。

    Abstract:

    Combining Propidium Monoazide Bromide (PMA) with real-time quantitative (qPCR) to detect the number of the live bacteria of kiwifruit cancer dominant pathogen in Shaanxi province. The optimal condition for PMA-qPCR to distinguish between live and dead ulcer bacteria was determined by optimizing the optimum concentration of PMA, incubation time and light exposure time. The results showed that all Psa were killed when treated by boiling water bath at 98.3 ℃ for 13 min. When the concentration of dead Psa was 1×107 CFU/mL, the suitable concentration of covalent crosslinking between PMA and dead Psa was 105 μg/mL, the best incubation time was 8min and the best light exposure time was 20 min. Under this condition, no DNA amplification of the dead bacteria, and no effect on the DNA amplification of live bacteria. The linear regression equation established based on the Psa plasmid standard was Y=-3.220 4x+37.73, for which R2=0.995 5. It can detect the Psa in the 6.39×102 copies/μL at minimum. The established PMA-qPCR method can detect 2.38×102 copies/μL Psa at minimum. By using the sample of artificially infected branches, the minimum detection limit was 6.30×104 CFU/mL,consistent with the detection results of colony counting method.

    参考文献
    相似文献
    引证文献
引用本文

肖妍,刘芸宏,高贵田,等. PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究[J].食品与机械,2019,(4):48-53.
XIAOYan, LIUYunhong, GAOGuitian, et al. PMA-qPCR for detecting live bacteria of Shaanxi kiwifruit cancer dominant pathogen[J]. Food & Machinery,2019,(4):48-53.

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  • 收稿日期:2018-11-28
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  • 在线发布日期: 2022-11-26
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